Revista Latinoamericana de Tecnología Extracorpórea

Background and Aims: Ethylene oxide (chemical formula C2H4O) is a fumigant fungicide and inseticide that has been used to sterilize medical devices. Residues of ethylene oxide and its reaction products may be hazardous, it is essential for the manufactures to be aware of the possible occurrence of residues in the product.

Methods: Perfusion cannulas were sterilized with 450mg/L of EtO for 2 hours at a temperature of 45+ 55 C, and placed at aeration room with 35 C and 26 change of air per hour. We used a validated method of extraction according to rule ISO 10.993.7: 1995 (R) :2001. The determination of the amount of residual EtO has and the time of aeration determined by gas chromatography.

Results: The time of aeration verified between all perfusion cannulas was from 19 to 28 hours , under validated conditions.

Conclusions: Determination of aeration times shall be specified after ethylene oxide sterilization process.

Rev Latinoamer Tecnol Extracorp 10,4,2003

Histórico e Objetivos: O óxido de etileno (fórmula química C2H4O) é um fungicida e inseticida fumigante que tem sido utilizado para esterilizar dispositivos médicos. Os resíduos do óxido de etileno e seus produtos de reação podem ser perigosos; é essencial aos fabricantes estar cientes da possível ocorrência de resíduos nos produtos.

Métodos: Cânulas de perfusão foram esterilizadas com 450 mg/L de óxido de etileno por 2 horas à temperatura de 45±55⁰C e colocadas em sala de aeração a 35⁰C e 26 trocas de ar por hora. Nós usamos um método de extração validado de acordo com as regras ISO 10.993.7: 1955 (R): 2001. A determinação da quantidade de óxido de etileno residual foi feita por cromatografia a gás.

Resultados: O tempo de aeração verificado para todas as cânulas de perfusão foi de 19 a 28 horas, sob as condições de validação.

Conclusões: A determinação dos tempos de aeração deve ser especificada após os processos de esterilização pelo óxido de etileno.

Em razão das suas propriedades bactericida, tuberculicida, fungicida e esporicida, o óxido de etileno tem sido utilizado desde a segunda guerra mundial na esterilização de artigos médico-hospitalares uma vez que este também é compatível à natureza físico-química dos materiais termo, higro e radio sensíveis [1]. O seu principal uso industrial reside na petroquímica leve, onde é aplicado na síntese de fibras de poliéster, embalagens e filmes plásticos. O óxido de etileno chegou até a ser utilizado na agricultura no controle de pragas. A sua atividade antimicrobiana deve-se a alquilação de componentes celulares nucleofílicos, tais como os grupos amino, fenólicos, sulfidril e carboxil. Nas células vegetativas ou esporos bacterianos, a substituição do hidrogênio por um grupo hidroxietil pode levar à interrupção ou término de atividades metabólicas e reprodutivas, resultando em danos e morte celular. Evidências experimentais indicam que a reação primária do EtO é com os ácidos nucléicos, causando a perda da capacidade reprodutiva do microrganismo [2]. Apesar das características esterilizantes ideais apresentadas pelo óxido de etileno, alguns sintomas como dor de cabeça, náusea, vômito, dispnéia, e irritações respiratórias foram relatadas quando numa inalação do vapor do gás esterilizante por humanos. Os efeitos em humanos de uma exposição repetida a baixas concentrações do agente não estão bem documentadas, porém casos reportados indicam que tais exposições podem estar associadas aos efeitos neurológicos ( dor de cabeça, letargia, apatia e neuropatia senso motora) [3].

Estudos epidemiológicos sugerem uma relação entre o aumento da incidência de câncer no pâncreas, gástrico, de mama, leucemia e doença de Hodgkins e a exposição crônica ocupacional ao EtO [4].

O Ministério da Saúde considera o EtO um agente potencialmente mutagênico, carcinogênico e teratogênico e de acordo com a portaria interministerial nº 482 de abril de 1999, estabeleceu um limite máximo de exposição ocupacional de 1 ppm para TWA ( time weighted average - período de oito horas de trabalho por dia) e 5 ppm para STEL ( short-term-exposure limit - período de quinze minutos diários) [5,6]. Já o limite máximo permitido de resíduos de óxido de etileno em dispositivos médico-hospitalares após os processo de esterilização, resterilização ou reprocessamento foi de 25 ppm, [7,8,9,10,11,12,13]. Relatos atestam que as concentrações do EO residuais acima dos limites em artigos médicos causam lesões cutâneas e hemólise. A remoção residual do óxido de etileno em produtos é normalmente realizada em câmaras de aeração com lavagens múltiplas de ar que pode ser aquecido. As análises de detecção do gás em produtos ou ambientes são realizadas a partir de cromatografia gasosa. No monitoramento ocupacional são utilizados os métodos do tubo de carvão e difusão.

De acordo com a ISO 10993:1 (1995) (R 2201) [8] nenhum limite de exposição é determinado para etilenoglicol (EtG), porque a avaliação do risco indica que quando resíduos de óxido de etileno (EtO), são controlados conforme requerido é pouco provável que resíduos biologicamente significantes de etilenoglicol (EtG), estejam presentes. Pois o etilenocloridrina (EtC) e formado pelo EtO na presenca de ions cloreto e o etilenoglicol (EtG) e formado lentamente pela combinacao de EtO com agua [8].

O conhecimento dos riscos potenciais decorrentes das características inerentemente tóxica do óxido de etileno não deve ser razão de temor, mas sim conduzir à idealização de instalações, protocolos de validação de processos, salas de aeração; assim como equipamentos de proteção individual que permitam condições seguras de trabalho [14,15].

Quando da determinação da adequabilidade do óxido de etileno (EtO), para a esterilização de produtos para a saúde é importante assegurar que os níveis residuais de óxido de etileno (EtO), e etilenocloridrina (EtC); propiciem um risco mínimo para o paciente, pois se reconhece que o óxido de etileno apresenta diversos efeitos biológicos.

O emprego dos biomateriais na fabricação dispositivos artificiais vem desde o inicio do século, quando foi maciço seu uso nas restaurações odontológicas. No que diz respeito aos órgãos artificiais, embora experimentação mais criteriosa tenha somente ocorrido nos últimos 35 anos, estes encontram intenso uso terapêutico. Somente nos Estados Unidos, aproximadamente 13 milhões de procedimentos são feitos anualmente. Bombas de infusão de insulina são usadas em cerca de 10 mil pacientes. No planeta, estimou-se, em 1998, a introdução de 10 mil válvulas cardíacas, 300 mil marcapassos, 400mil próteses ortopédicas e 300 mil procedimentos de oxigenação sangüínea; cerca de 300 mil pacientes viviam graças a rins artificiais. Tais números tendem a crescer de forma inestimável à medida que ocorra a melhoria nos biomateriais, ao lado da introdução dos novos materiais e dispositivos ou procedimentos de uso com maior adequação. 16 Deste modo o processo esterilizante adotado, considerando a provável mistura de polímeros envolvidos, geralmente e o oxido de etileno o agente de escolha [17].

Na circulação extracorpórea, o sangue venoso é desviado do coração e dos pulmões ao chegar ao átrio direito do paciente, através de cânulas colocadas nas veias cava superior e inferior (figura1).

Figura 1.Procedimento de canulação em circulação extracorpórea.
Daí, por uma linha comum, o sangue venoso é levado ao oxigenador, onde, através de um percurso por câmaras especiais, recebe oxigênio e elimina gás carbônico e, em seguida, é coletado para ser reinfundido ao paciente. Este circuito extracorporeo (oxigenador, linhas de recirculação, conectores e cânulas) é construídos por diferentes biomateriais como, por exemplo: acrílico policarbonato e PVC (poli cloreto de vinila) [18].

A cânula é o ponto de menor calibre, e, portanto, de maior resistência, de todo o circuito extracorpóreo. Existem cânulas de diversos tipos, modelos e performance hemodinâmica. São construídas de plástico; algumas têm a ponta de metal, aço laminado ou alumínio, cujas paredes são mais finas. Estas últimas tem o diâmetro interno maior que as de plástico do mesmo calibre externo. Recomenda-se utilizar o maior diâmetro possível, proporcional ao peso do paciente e ao fluxo previsto. O tamanho adequado, segundo Kirklin, deve ser o que apresente um gradiente de pressão inferior a 100mmHg, com o fluxo máximo calculado para o paciente. Aquele gradiente representa a diferença entre a pressão da linha arterial e a pressão arterial média do paciente [18].

A partir do estabelecimento da dose máxima diária de EtO e EtCH que um produto para a saúde pode liberar aos pacientes, devem ser classificados de acordo com a duração do contato. Os produtos devem ser enquadrados em uma das três categorias de exposição em concordância:

Exposição limitada: produtos cujo uso ou contato, único ou múltiplo, não exceda 24 h;
Exposição prolongada: produtos cujo uso ou contato, único, múltiplo, ou de longo-prazo, exceda 24 h, mas não 30 dias;
Contato permanente: produtos cujo uso ou contato, único, múltiplo, ou de longo-prazo, exceda 30 dias.

As cânulas de perfusão são classificadas como artigos críticos, pois entram em contato direto com o tecidos ou trato estéreis (correlato que contatam o sangue); e de acordo com a portaria 482MS6. 7são produtos de exposição limitada: produtos cujo uso ou contato, único ou múltiplo, não exceda 24 h;

Limites máximos

Limites residuais estabelecidos aos produtos para a saúde no Brasil [6,7].

Óxido de etileno	</- 25 ppm
Etilenocloridrina	</- 25 ppm
Etilenoglicol	</- 250 ppm

a) Determinar o tempo de exposição ao óxido de etileno para garantir um nível de esterilidade de 12 ciclos logarítmicos (SAL 10^-6);

b) Determinar a concentração de oxido de etileno e etilenocloridrina (EtO, EtC e EtG)) em cânulas de perfusao venosa e arterial; após processo de esterilização;

c) Determinar através da curva de regressão linear ou curva de dissipação de gases o tempo necessário de aeração para remoção destes resíduos em 04 (quatro ) tipos de cânulas venosas e 04 (quatro) tipos de cânulas arteriais; sendo que as cânulas foram escolhido de acordo com o mais elevado volume de utilização.

04 tipos de cânulas Venosas de PVC leve, reforçadas interiormente com uma armação de aço inoxidável:

Cânula Venosa: 28 Fr (12.7 mm) x 40 cm (16¨) REF TF 038L. Lote 58105820;
Cânula Venosa: Tamanho 36/51 Fr (12/17mm)- Comprimento 15 (37.5cm). REF: TR3651L. Lote 5811051;
Cânula venosa 36/46 Fr (12.0/15.3 mm) x 37.5cm (15 ") REF: TF 36460". Lote 58107443;
Cânula Venosa 28 Fr (12.7 mm) x 40 cm (16¨) REF TF 036L. Lote 58106124.

04 tipos de cânulas arteriais de PVC leve:

Cânula Aortica ARL 201190A -Tamanho 20FR comprimento 11 polegadas (28cm) conector 3/8 polegadas (9,5mm), Lote 58105178;
Cânula Aortica ARL 241190 Tamanho 24 FR (8,0mm) comprimento 11 polegadas (28cm), Lote 58105815;
Cânula Aortica Tamanho 20 Fr (6,7mm) x 28 cm (11 polegadas)ARS 020CSTA. Lote 58108391;
Cânula Aortica ARS 024CSA Tamanho 24 FR (8mm) comprimento 11 polegadas (28cm), conector 3/8 polegadas( 9,5mm), Lote 58107836.

Outros Materiais

Indicador Biológico Bacillus subtilis ATCC 9372 var.niger( Bacillus atrophaeus), (2,8 x106 esporos/unidade).Lote RS 000150 SGM-Strip TM Bozeman, Montena 59715. Data da fabricação 12/10/2002 Data de expiração: 12/10/2003;
Meio de cultura: Releasat TM Biological Indicator Culturing Test - SGM-Biotech, INC Lote 000150. Data da fabricação 12/10/2002 Data de expiração: 12/10/2003;
Câmara de esterilização de processo de aço inoxidável volume 11,7m3;
Cromatografo gasoso H P 6890, com detector de ionização de chama;
Computador com softwares windows NT, chemistation e HP 7694;
HOBO R. H8 PRO/Temp /RH Logger HOBO R Pro Sereies.
Fluxo Laminar Classe 100- Marca TROX;

O ciclo de esterilização foi realizado em uma câmara de 11,7 m3, com 02 horas de exposição; a concentração de 450 mg/L de 10% de ETO e 90% de CO2, temperatura de trabalho (45-55 C) e umidade relativa (30-90%). O posicionamento das 16 (dezesseis) cânulas dentro da câmara de esterilização foi de acordo com a figura 2, sendo 06 cânulas próximas à porta de entrada, 05 no centro da câmara de esterilização, 06 próximas a porta de saída da câmara. Após o ciclo de esterilização as cânulas foram colocadas em sala de aeracao forçada ( 35 C e 26 trocas de ar por hora), em tempos pre - definidos uma amostra foi retirada e submetida à extração e posteriormente a determinação dos níveis residuais. Para controlar a eficiência do processo de esterilização utilizou-se o indicador biológico Bacillus subtilis ATCC 9372 ( Bacillus atrophaeus), distribuídos na câmara de acordo com requisitos da ISO 11135: 2000 (Medical devices -- Validation and routine control of ethylene oxide sterilization.) [16]. As cânulas foram inoculadas com o indicador biológico com uma população microbiana conhecida de 2,8 x 106 unidades formadoras de colônias(UFC), posicionadas de acordo com a figura 2;

Figura 4. Inoculação do IB dentro da cânula. Análise de óxido de etileno residual

O método de extração das cânulas foi por imersão de acordo com requisitos da ISO 10993-7:2001 (Biological evaluation of medical devices, Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals). Onde através da extração de uso simulado após o ciclo de esterilização as cânulas foram pesadas, cortadas e imersas em 100 mL de água purificada, permanecendo em estufa a 37°C por 06 horas. Após este período o extrato foi analisado por cromatografia gasosa (ISO 10993-7: 2001 (Biological evaluation of medical devices, Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals)- figura 5.

Figura 5. Fluxograma do método de extração e análise do resíduo de EtO, EtG e EtC.
ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA

Foi analisados nas cânulas, resíduos de óxido de etileno (EtO), etilenocloridrina (EtC) e etilenoglicol (EtG), os padrões de referência utilizados estavam acompanhados de certificados rastreáveis e com concentrações conhecidas para fins de cálculo.

O padrão de estoque de EtO com teor de 0,5 % (w/w) em 99,5 % de acetona, e refrigerado de 2 a 8 ºC por um período de 60 dias.

O padrão primário de EtC com teor de aproximadamente 1.194.000 ug/mL, diluído para 11.940? ug/mL em um balão volumétrico de 100 mL com água purificada para preparação do padrão de estoque. O padrão de estoque foi refrigerado a uma temperatura entre 2 a 8 ºC por um período máximo de 30 dias.

O padrão primário de EtG com teor de aproximadamente 1.110.000 ug/mL, diluído para 111.000 ug/mL em um balão volumétrico de 100 mL com água purificada para preparação do padrão de estoque. O padrão foi refrigerado a uma temperatura entre 2 a 8 ºC por um período máximo de 30 dias.

Os padrões de trabalho foram diluídos de acordo com a concentração do padrão de estoque, de 3.710,0 ug/mL para o EtO, 11.940,0 ug/mL para o EtC e 111.000,0 ug/mL para o EtG, sendo utilizado como a referência para os cálculos da curva de calibração do aparelho. Foram feitas três concentrações diferentes de padrões de trabalho, no EtO e no EtC, as concentrações serão em torno de 5, 25 e 50 ug/mL e no EtG as concentrações serão em torno de 50, 250 e 500 ug/mL, esses valores foram selecionados, pois abrangem os limites estabelecidos.

As três soluções foram feitas em balão volumétrico de 10 mL, o padrão de trabalho I foi com concentrações de EtO, EtC e EtG em torno de 5, 5 e 50 ug/mL respectivamente e as alíquotas foram:

14 uL de EtO, para concentração 5,194 ug/mL;
04 uL de EtC, para concentração 4,776 ug/mL;
05 uL de EtG, para concentração 55,500 ug/mL
O padrão de trabalho II foi com concentrações de EtO, EtC e EtG em torno de 25, 25 e 250 ug/mL respectivamente e as alíquotas foram:

68 ug/L de EtO, para concentração 25,228 ug/mL;
21 ug/L de EtC, para concentração 25,074 ug/mL;
24 ug/L de EtG, para concentração 266,400 ug/mL.

O padrão de trabalho III foi com concentrações de EtO, EtC e EtG em torno de 50, 50 e 500 ug/mL respectivamente e as alíquotas foram:

135 ug/L de EtO, para concentração 50,085 ug/mL;
42 ug/L de EtC, para concentração 50,148 ug/mL;
45 ug/L de EtG, para concentração 499,500 ug/mL.

O aparelho utilizado para análise de EtO, EtC e EtG foi o CG System da Hewlett Packard, série HP6890 acoplado a o injetor automático da mesma série. Cada um dos padrões de EtO, EtC e EtG foram injetados duas vezes e o desvio padrão relativo (%RSD) da curva padrão não excedeu 5% para EO e EtC e 10% para EtG no intervalo de padrões utilizados e o coeficiente de correlação (r) foi em seu valor ao quadrado (r²) maior que 0,99.

O software chemstation realiza as curvas de regressão e forneceu os resultados de concentração (ug/mL) automaticamente a partir da curva de calibração.

O nível de resíduo foi calculado a partir da concentração em microgramas por mililitro (ug/mL) multiplicado pelo volume (mL) do extrato, dividido pela massa (g) da cânula de perfusão.

A concentração de óxido de etileno residual foi obtida utilizando-se a seguinte equação:

CEO = concentração de óxido de etileno residual em ppm
Aa = área cromatográfica da amostra
Ap = área média cromatográfica do padrão
MEO = massa de óxido de etileno padrão
Ma = massa da amostra

Curva de dissipação foi utilizada para estimar o tempo pós-esterilização requerido para que as cânulas alcançassem limites residuais aceitáveis.

Uma curva do logaritmo natural da concentração de EtO determinada experimentalmente contra o tempo após esterilização foi linear. A análise de regressão dos resíduos, para estabelecer a natureza da curva de dissipação, permitindo que o produto seja liberado no limite previsto (LP) calculado, superior a 95% para o limite residual permitido para o produto. Fórmulas para calcular limite previsto, LP:

Onde:

x₀	é o valor médio calculado do tempo de liberação correspondente ao limite de EtO;
y₀	é o valor log do limite de EtO;
a	é a intersecção da linha de regressão linear;
b	é a inclinação da linha de regressão;
LP	é o limite previsto para uma unidade simples do produto;
t_a	é o valor t-student com significância alfa e grau de liberdade n-2;
(S_a)²	é a variância residual da linha de regressão;
y_u	é a média de valores de log EtO;
n	é o número de valores;
x_i	é o tempo individual após esterilização no qual as medidas são realizadas;
x_u	é a média dos tempos após a esterilização;
n	é o número de valores;
	é o somatório dos quadrados para x (tempo).

Cânula	Tamanho	Comprimento	Conector	EtO *(25ppm)	EtC /*(25 ppm)	EtG/*(250 ppm)
TF 038L	38FR (12,7mm)	50cm (16polegadas)	3/8	26 horas	< 1 hora	< 1 hora
TF 36460	36/46FR (12,0/15,3mm)	37,5cm (15polegadas)	1/2	27 horas	< 1 hora	< 1 hora
TF3651L	36/51FR (12,0/17,0mm)	37,5cm (15polegadas)	1/2	20 horas	< 1 hora	< 1 hora
TF036L	36fr (12,0mm)	40,0cm (16polegadas)	3/8	27horas	< 1 hora	< 1 hora
ARS024CSA	24FR (8,0mm)	28cm (11 polegadas)	3/8	25horas	< 1 hora	< 1 hora
ARS020CSTA	20FR (6,7mm)	28cm (11polegadas)	3/8	20 horas	< 1 hora	< 1 hora
ARL201190A	20FR (7,3mm)	28cm (11polegadas)	3/8	28 horas	< 1 hora	< 1 hora
ARL241190	24FR (8,0mm)	28cm (11polegadas)	3/8	19 horas	< 1 hora	< 1 hora

*Tempo em horas necessário para atingir os níveis residuais de acordo com a Portaria 482/MS, produto em sala de aeração forçada com temperatura de 35C e 26 trocas de ar por hora. ** Para EtC e EtG , o tempo necessário foi < 1 hora.

Sendo o tempo de redução decimal de 10 minutos (figura 3), determinado para os esporos de B. Subtilis ATCC 9372 (Bacillus atrophaeus), presentes no indicador biológico os tempos necessarios de exposição ao EtO (450mg/L de 10% de EtO e 90% de CO2) foram:

- Para a redução de 06 ciclos logaritmicos de esporos no indicador biológico foi de 60 minutos;
- Para garantir nível de esterilidade SAL 10^-6 o tempo necessário foi de 120 minutos.

Segundo, recomendação do Ministério da Saúde no ambiente hospitalar normalmente recomendam um ciclo ou tempo de exposição entre 105 minutos e 120 minutos [21]. Isto é explicado pois ; difusao em certos materiais como tecidos, plasticos e principalemnte borrachas, depende [21,22] :

-natureza do produto
-espessura do material (densidade)
-embalagem do produto [21]. Reforçando assim os resultados encontrados para o tempo de exposição das cânulas, conforme mencionado acima.

b) Residuos de Eto,EtC e EtG após exposiçao ao óxido de etileno ( Após ciclo de esterilização antes da sala de aeração)

Cânula	EtO (ppm)	EtC (ppm)	EtG (ppm)
TF038L	765,41	16,88	163,42
TF36460	363,28	7,38	183,65
TF3651L	409,43	8,20	189,37
TF036L	658,51	14,77	283,13
ARS024CSA	564,64	6,71	105,22
ARS020CSTA	330,64	9,15	137,53
ARL201190A	563,71	4,18	70,97
ARL241190	459,92	4,42	94,05

Todas as cânulas possuem afinidade com o óxido de etileno; apresentando um residual após o ciclo de esterilização entre 330,64ppm a 765,41ppm de EtO; deste modo grande capacidade retenção, pois são materiais plasticos com grande afinidade ao gás esterilizante e retenção de resíduos ; sendo necessario um tempo de aeracao em media superior a 20 horas.

C) tempo de aeração necessário para alcançar limtes residuais aceitaveis:

As oito (08) cânulas analisadas apresentaram resultados quanto ao tempo em horas para a eliminação dos resíduos de Eto entre 19 e 28 horas (tabela 1), sendo observado semelhanças destes resultados entre cânulas de diferentes tamanhos e cumprimentos; com exceção a cânula aórtica ARL 241190 que apresentou um tempo de aeração inferior as demais (19 horas) Isto deve-se a própria metodologia adotada pois na sua validação analitica observou e aceitou-se um desvio padrão < 5% e exatidão de +- 4%.

Na validação relativa ao aspecto de eliminação de resíduos de oxido de etileno e seus derivados, novamente a diversidade de materiais poliméricos, com distintas características de absorção e adsorsão, constitui uma fonte de estudo, pois a remoção incompleta de tais agentes pode se constituir em agentes de irritacao ou dano aos tecidos dos pacientes. Todos os produtos para a saúde esterilizados por óxido de etileno devem ser aerados o suficiente para permitir a saida de qualquer residuo, prevenindo assim qualquer toxicidade do material esterilizado ao paciente durante a utilização.

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DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE ÓXIDO DE ETILENO, ETILENOCLORIDRINA E ETILENOGLICOL EM CÂNULAS DE PERFUSÃO APÓS PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO.