Revista Latinoamericana de Tecnologia Extracorpórea XI,4,2004

LOS EFECTOS IN VITRO DE LA APROTININA EN 12 PRUEBAS DE ACT DIFERENTES.

Karen Jones, BS, CCP; Fasi Nasrallah, MD; Edward Darling,BS,CCP; Nicole Clay, BS, Bruce Searles, BS, CCP.
Departamentos de Perfusion y Anestesia Cardiovascular, SUNY Upstate Medical University, Syracuse, Nueva York.
Presentado en la 40ava Conferencia Internacional de la Sociedad Americana de Tecnología Extracorpórea,
Nueva Orleans, Louisiana, Marzo 21-24, 2002.
Publicación Original: The J Extracorp Technol 36,1,51-57,2004. Traducido del original con permisión de los editores.
Traducción: Solange Vázquez, Perfusionista. Caracas, Venezuela.

ABSTRACT

Aprotinin is frequently used during CPB to reduce post-operative bleeding and attenuate the inflammatory response. The level of anticoagulation in these patients is monitored by using various activated clotting time (ACT) tests, which are generally accepted as being altered by the presence of aprotinin in blood. Therefore, we have investigated the effect of aprotinin on several ACT tests using whole blood from CPB patients. With IRB approval, blood samples were collected from patients undergoing CPB before and after full heparinization (300 u/kg). Each blood sample was divided into two aliquots, and aprotinin was added to one of them to yeld a final calculated concentration of 300 KIU/ml. Both aliquots were used simultaneously to perform the 12 ACT tests. A paired Student´s t-test was performed on the data. Overall, test results from 9 of 12 devices were significantly increased by aprotinin. Of these, four were increased only when the sample was heparinized, three were elevated by both heparinized and unheparinized blood, and two were elevated only when the sample was unheparinized. Each affected test responded uniquely to aprotinin, producing ACT test results ranging from 12 to 51% above nonaprotinized values. Several tests that were affected by aprotinin using heparinized blood samples were unaffected using unheparinized blood samples. These data emphasizes the unique manner in which individual tests respond to aprotinized blood samples and should be considered when developing institutional policy for anticoagulation of aprotinized patients.

Keywords: activated clotting time (ACT), aprotinin, cardiopulmonary bypass (CPB), anticoagulation.

Rev Latinoamer Tecnol Extracorp 11,4,2004

RESUMEN

La aprotinina es frecuentemente usada durante la circulación extracorpórea (CEC) para reducir el sangrado post operatorio y atenuar la respuesta inflamatoria. El nivel de anticoagulación en estos pacientes es determinado realizando varias pruebas de tiempo de coagualación activado (TCA), las cuales generalmente se acepta que han sido alteradas debido a la presencia de la aprotinina. Por lo tanto, hemos investigado el efecto de la aprotinina en muchos tipos de aparatos de TCA utilizando sangre completa de pacientes en CEC. Con la aprobación de la IRB, las muestras fueron colectadas de pacientes sometidos a CEC antes y despues de la heparinizacion completa (300 KIU/kg). Cada muestra de sangre fue divida en dos alicuotas, y la aprotinina fue añadida a una de ellas para alcanzar una concentración calculada de 300 KIU/mL. Ambas alicuotas fueron usadas para realizar 12 pruebas de TCA simultáneas. Se utilizó una prueba de t de Estudio, pareada (a paired "Student's t-test). En general, los resultados de 9 a 12 equipos estuvieron significativamente elevados por la aprotinina. De estos, cuatro fueron elevados solo cuando la muestra era heparinizada, tres fueron elevados con y sin sangre heparinizada y dos eran elevados solo cuando la muestra no fue heparinizada. Cada prueba afectada respondió unicamente a la aprotinina, produciendo resultados de TCA entre 12 a 51 % por encima de los valores de las muestras de sangre sin aprotinina. Varios pruebas que fueron afectadas por la aprotinina usando sangre heparinizada, no lo fueron cuando se usó sangre no heparinizada. Esta información hace énfasis en la singular manera en que cada prueba individual de TCA responde a las muestras de sangre con aprotinina y debe ser tomado en cuenta cuando se desarrolle una politica institucional para la anticoagulación en pacientes con aprotinina.

Palabras-claves: Tiempo de Coagulacion Activado (TCA) Aprotinina, CEC (Circulación Extracorpórea) anticoagulación.

INTRODUCCIÓN

En los Estados Unidos, aproximadamente 700.000 pacientes son sometidos a CEC para cirugia de corazón y/o aórtica cada año (Estadísticas de la American Heart Asociation, 1998). La practica estandarizada para estos procedimientos incluyen anticoagulación inducida por heparina que es evaluada durante el caso usando equipos de tiempo de coagulación activada (TCA). (1,2)

La aprotinina es frecuentemente usada durente CEC por sus propiedades anti-inflamatorias (3,4) y antifibrinolíticas (5,6,7) y para disminuir la pérdida de sangre en el post operatorio (5,8,9,10). Inhibe las proteasas serica calicreina y plasmina, las cuales median la fibrinolisis, y tambien previene la disfunción plaquetaria inducida por la heparina (2).

Cuando la aprotinina es administrada intravenosa, demuestra un efecto farmacocinético plasmático relaciondo a la dosis administrada. Se ha reportado que una concentración de 200-250 KIU/mL es requerida para inhibir la calicreina y una concentración de 50-125 KIU/mL para inhibir la plasmina. Han sido sugeridos varios regimenes de dosis de aprotinina, y un amplio rango de concentraciones plasmáticas de aprotinina ha sido utilizado clinícamente. Un tratamiento particular es el regimen de alta dosis de aprotinina que requiere la infusión intravenosa de dos millones de KIU de aprotinina despues de la inducción anestésica, seguido de una infusión de quinientos mil KIU de aprotinina durante la operación. Dos millones de KIU de aprotinina son agregados al cebado del circuito de CEC (11). Este regimen de alta dosis fue utilizado en un estudio de Dietrich et al, y se midió una concentración plasmática de aprotinina de 335 ± 106 KIU/mL durante 5 minutos luego del comienzo de la CEC en los primeros 20 pacientes (5).

Numerosos autores han sugerido que las pruebas de TCA son elevadas en pacientes tratados con aprotinina (7,12,13). Aun asi, otros no han reportado ninguna elevación del TCA en pacientes que recibieron aprotinina (14). A pesar de que el mecanismo exacto del efecto de la aprotinina sobre las pruebas de TCA es incierto, es evidente que diferentes equipos de TCA y activadores responden de manera diferente bajo las mismas condiciones (15). Tambien, la literatura describe solamente unas pocas de las muchas pruebas de TCA que se realizan clinicamente. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue investigar el efecto de una concentración clinicamente relevante de aprotinina en los resultados de muchas pruebas de TCA comunmente usadas con sangre de pacientes sometidos a CEC.

MATERIALES Y METODOS

Selección del paciente

Todos los pacientes programados para procedimientos quirúrgicos cardiacos que requerian la circulación extracorpórea fueron considerados para este estudio de la IRB (Institutional Review Board). Los criterios de inclusión requerian que los pacientes tuviesen por lo menos 18 años de edad, un hematocrito de 38% o mayor, y una superficie corporal de 1.2 m2 o mayor. Los testigos de Jehova, mujeres embarazadas y pacientes con desordenes de coagulación conocidos fueron excluidos de este estudio. Un informe de consentimiento escrito se obtuvo de cada paciente que cumplia con los criterios anteriormente mencionados.

Pruebas y Aparatos de Tiempo de Coagulación activado TCA

Los doce tipos diferentes de pruebas y aparatos específicos de TCA utlizados para realizar los exámenes se muestran en la Tabla 1. El funcionamiento de cada aparato fue verificado con pruebas de control de calidad electrónica y líquida de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.



Conducta de la Circulación Extracorpórea

Siguiendo la induccion anestésica y luego de asegurar la estabilidad hemostática, los pacientes fueron sistemáticamente anticoagulados con 300 u/kg de heparina de pulmón bovino. La CEC fue iniciada usando bomba centrifuga, oxigenador de membrana y filtro en la linea arterial. Se alcanzó hipotermia de 30 a 34 ºC durante la CEC. El cebado pre bomba consistia en 1350 mL de Solución de Ringer Lactato, 5000 unidades de heparina, 50 mEq de Bicarbonato de Sodio, 12,5 g de manitol y 5g de ácido aminocaproico. Se agregó heparina adicional al circuito extracorpóreo para mantener niveles de ACT mayores a los 400 segundos. El equipo utilizado para medir el ACT durante CEC fue el Sonoclot II Analizador de la Función Plaquetaria y Coagulación (Sienco Inc., Morrison, CO). La heparina fue revertida con protamina ( 1mg/kg) al finalizar el caso.

Colección de la Muestra de Sangre

Las muestras de sangre heparinizadas y no heparinizadas fueron tomadas por un solo técnico, y cada muestra fue dividida en dos alicuotas ( A1 y A2). Se añadió Aprotinina, 0.03 ml de aprotinina por cada 1 mL de sangre, hasta alcanzar una concentración calculada de aprotinina de 300 KIU/mL. Las pruebas de ACT se realizaron por duplicado usando A1 y A2. La figura 1 ilustra la toma y protocolo de muestra. El protocolo de muestra fue repetido durante dos periodos de tiempo, antes y despues de la heparinización durante la CEC.

Comparación y Análisis Estadístico

Las pruebas duplicadas fueron realizadas en A1 y A2. Los resultados de las pruebas duplicadas fueron promediados para definir un punto de información experimental. Cuando las pruebas duplicadas no estaban disponibles, se utilizaron numeros "raw" . Esto ocurrió algunas veces debido a un mal funcionamiento de la prueba. Los TCA que excedieron los 1000 segundos fueron interrumpidos, y los valores menores a 70 fueron eliminados de la información debido a la irrelevancia clinica. Los falsos negativos fueron identificados y eliminados de acuerdo al método de Grubb para falsos negativos. La informacion de cada prueba fue expresada como un promedio ± de la desviación estandar. Se realizaron pruebas-t pareadas, y la significación estadistica se definió con valores p menores de 0.05.

RESULTADOS

La Tabla 2 muestra una lista para cada prueba con la comparación de los resultados de TCA con y sin heparina, antes y despues de la heparinización completa. En general, 9 de 13 pruebas estaban aumentadas por la aprotinina. En estos, tres se encontraban aumentadas con sangre heparinizada y con sangre no heparinizada, y cuatro se encontraron aumentadas solo cuando la muestra con aprotinina fue heparinizada.


La figura 2 ilustra el porcentaje de cambio de los resultados de TCA con o sin aprotinina tanto para las muestras heparinizadas y no heparinizadas. Se realizarón cuatro pruebas de Celite, cinco de caolin, una con activador múltiple y dos con perlitas de vidrio.


Para las muestras de sangre no heparinizada (barras blancas), tres de las pruebas con celite se elevaron significativamente con la adición de aprotinina. El porcentaje de cambio en esta prueba de TCA estuvo en un rango de 12 - 21 %. Para las muestras de sangre heparinizada (barras negras), cuatro pruebas de celite se elevaron significativamente con la adición de aprotinina, el porcentaje de cambio de esta prueba estuvo en un rango desde 27-51%. Tres pruebas con caolin se elevaron significativamente con la adición de aprotinina a la sangre heparinizada, el porcentaje de cambio de esta prueba estuvo entre 4 - 16 %. Ambas pruebas con perlitas de vidrio se elevaron significativamente con la adición de aprotinina a la sangre no heparinizada ( 23-28 % de aumento). Estas pruebas no fueron realizadas usando sangre completamente heparinizada porque no estan diseñadas para ser usadas en muestras con altas dosis de heparina.

La figura 3 muestra el efecto de la aprotinina en los valores de las pruebas de TCA de las muestras de sangre heparinizada y no heparinizada. De 12 pruebas, cinco se elevaron significativamente con las pruebas no heparinizadas. El cambio en los valores de TCA en estas pruebas variaron entre 12-28 %. Seis de las 10 muestras heparinizadas realizadas se elevaron significativamente. El cambio en los valores de TCA varió entre 9 - 51%.



DISCUSIÓN

Los efectos de la aprotinina en los resultados de TCA han recibido una gran atención y generado numerosos artículos cientifícos. Existe un fuerte consenso sobre la elevación significativa de los valores de las pruebas activadas con celite (16-24), y que los resultados de las pruebas activadas con caolin no son significativamente prolongadas con la aprotinina (14,17,19,20,23,24). Nuestra información no refuta los resultados de otros autores pero está en conflicto con el dogma actual, el cual sugiere que todas las pruebas con celite son afectadas por la aprotinina, y todas las pruebas con caolin no son afectadas.

Históricamente, las investigaciones sobre este tópico han sido completadas usando solo un número limitado de pruebas de TCA clinicamente disponibles. De diez articulos de referencia que hablan de las pruebas con caolin, solo dos exámenes diferentes, ITC's FTCA510, (16,17,19,-24) y HMT de Bayer (1,18), son los que han sido investigados previamente. Aun más, de seis referencias de artículos en relación con pruebas de caolin solamente dos tipos de exámemes diferentes fueron usados. Cinco autores usaron o prepararon una prueba con caolin similar al ITC's FKT-TCA, (14,19,20,23,24) mientras que los test de otros autores eran similares a los de la Hepcon HR-ACT (17,20)

Muchos clínicos han extrapolado los resultados de estas pruebas específicas a diferentes fabricantes de equipos de TCA con el mismo activador. Esto es inapropiado y ha conducido a un concepto equivocado que es tan persuasivo que ha sido impreso en libros de texto. El libro "Cardiopulmonary Bypass. Principles and Tchniques of Extracorporeal Circulation", dice que " el incremeto de el TCA puede ser… solo un efecto in vitro que puede estar particularmente pronunciado con celite, pero no con caolin como activador". Esto demuestra como la investigacion limitada ha dirigido generalizaciones a todas las pruebas con el mismo activador.

Cada una de las pruebas investigadas en nuestro estudio respondieron a la aprotinina en forma única, lo cual contradice las afirmación de que todos los aparatos de TCA con el mismo activador reaccionan a la aprotinina de igual manera. Con respecto a las pruebas activadas con celite, nuestra información apoya los resultados de autores anteriores que han encontrado pruebas FTCA510 elevadas en presencia de aprotinina. que de hecho, fueron elevadas por la aprotinina realmente. Todas las demás pruebas con celite se encontraron elevadas pero en diferentes grados. Y todas las pruebas con celite tuvieron valores variables en el porcentaje de cambio de los resultados de TCA.

De las tres pruebas de caolin investigadas en nuestro estudio, dos de esas pruebas se elevaron significativamente por la adición de aprotinina en muestras de sangre heparinizadas. Sus resultados, aun asi, fueron menos pronunciados que los de las pruebas con celite. El HR-TCA y K-TCA estuvieron elevados ambos en un 9- 16 %, en muestras heparinizadas y no heparinizadas, respectivamente. Nuestra informacion apoya los hallazgos de otros autores con respecto al FKT-TCA el cual no es afectado por la aprotinina. Las publicaciones sobre la prueba de HR-TCA con caolin no es concluyente. Algunos autores han dicho que con la heparinizacion, el valor del ACT era elevado (16,25); mientras que otros sugirieron que no se producen cambios en la prueba de HR-YCA (17).

A pesar, de que no existe actualmente literatura cientifica disponible con relación a las pruebas de TCA con caolin, en el GEM y Hemocron Jr. nosotros encontramos que estas no fueron afectadas, lo cual coincide con la literatura del producto con relación a estas pruebas. Para el momento de este estudio, no hay literatura científica o de producto que se refiera al efecto de la aprotinina sobre los exámemes de K-TCA, G-TCA, C-TCA, MAX-TCA, SonTCA y P214 TCA. P214 TCA. Nuestros resultados demuestran que todas nuestras pruebas excepto la MaxTCA reflejaron un aumento del TCA en presencia de aprotinina. Ninguno se elevo en el mismo grado, ilustrando la variabilidad de todas las pruebas.

Los resultados en este estudio no pueden ser explicados a través del margen aceptado de variabilidad entre las pruebas duplicadas. La variabilidad de resultados entre las pruebas con y sin aprotinina mostrada en este estudio es mayor que la reportada previamente por nuestro grupo entre las pruebas duplicadas bajo las mismas condiciones, a excepcion de una (15). La variabilidad de la prueba Gem TCA entre los grupos con y sin aprotinina con sangre heparinizada fue menor que la reportada en este estudio. La elevacion signficativa de los valores de TCA entre el grupo con aprotinina y sin aprotinina con la prueba GemTCA talvez no puede ser atribuida a la aprotinina sino a la variabilidad normal de este tipo de prueba.

La variabilidad entre las pruebas investigadas en este estudio pueden estar influenciadas por la relación entre el volumen del activador con respecto al volumen de sangre. Dietrich et al, sugieren que como la aprotinina esta cargada positivamente y el caolin negativamente, ambas moleculas se unen, y de esta forma eliminan el efecto anticoagulante de la aprotinina. El celite como es menos cargado negativamente que el caolin, se une menos a la aprotinina, quedando más para ejercer su efecto anticoagulante (26). Si existe una alta relación aprotinina-activador, menor cantidad se unirá dejando algo de aprotinina en la muestra para que ejerza sus efectos. Si existe una relación baja entre la aprotinina y el activador , entonces habrá suficiente activador como para unirse todo a la aprotinina no permitiendole que afecte la coagulación de la muestra de sangre.

Se puede proponer otra explicación teorica para la variabilidad entre las pruebas. Los diferentes fabricantes obtienen los agentes activadores de distintos vendedores quienes últimamente tienen diversos suplidores de materiales. Consecuentemente, pueden existir diferencias cualitativas entre las pruebas con celite o caolin de los diferentes fabricantes.

En conclusión, el TCA responde en forma singular a la aprotinina. Las pruebas de los diferentes manufacturadores con el mismo activador pueden reaccionar significativamente, ligeramente o no reaccionar en presencia de aprotinina. Cada prueba de TCA debe ser considerada separadamente y no ser agrupada de acuerdo al activador para predecir el efecto de la aprotinina sobre la prueba. Estos resultados deben ser considerados cuando se quiera desarrollar una política institucional sobre determinación de la anticoagulación en pacientes con aprotinina.

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