Revista Latinoamericana de Tecnología Extracorpórea

Recent advances in the field of molecular biology have led to a better understanding of the pathological mechanisms of cardiovascular disease. The impact of these findings will shape the future of treatment modalities for cardiovascular disorders. Postulated targets and biological rationale of new techniques are being developed in a race towards molecular therapies for vascular diseases. Wheter it is modulation of transmembrane cell receptors of phenotypic changes via vectors that mediate gene transfer, there is no doubt that molecular strategies will be an integral part of the future.

Here we examine past and recent perspectives, describe directions and challenges in cardiac and cardiovascular areas of research, and discuss relevance to the field of cardiovascular perfusion.

Los recientes avances en el campo de la biología molecular han llevado a un mejor entendimiento de los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad cardiovascular. El impacto de estos hallazgos es de tal importancia, que son los que darán forma en el futuro, de las modalidades de tratamiento para los desórdenes cardiovasculares. En la búsqueda de nuevas terapias moleculares para la enfermedad vascular, se están encontrando los objetivos buscados y se está comprendiendo el fundamento biológico. Sin lugar a dudas, que tanto sea por la modulación de los receptores celulares transmembrana o por cambios fenotípicos a través de vectores que median en la transferencia genética, estas estrategias serán en el futuro parte integral del tratamiento de las enfermedades vasculares.

En este trabajo se examinan los puntos de vista del pasado y actuales, se describen el curso y los desafíos en las distintas áreas de investigación cardiovascular y se discute su relevancia en el campo de la perfusión.

La enfermedad cardiovascular sigue siendo la causa mas importante de mortalidad en los países industrializados. Comenzando el siglo XXI una variedad de tecnologías intentan corregir este hecho.

Por ejemplo la utilización de stents de acero inoxidable para el tratamiento de la oclusión vascular ha dado muy buenos resultados, mejorando los resultados inmediatos obtenidos con la Angioplastía. Sin embargo las tasas de reestenosis sigue siendo un problema aún no resuelto. Lo mismo ocurre con la revascularización quirúrgica. Se han hecho progresos para disminuir el daño producido por el bypass cardiopulmonar (CEC) y hoy en día la CEC ha probado ser un método seguro y confiable para ser utilizado durante la revascularización coronaria, aun en una población de pacientes añosos. Asimismo con la selección de los conductos utilizados para el bypass coronario se han ido disminuyendo las tasas de oclusión alejada. A pesar de estos progresos todavía la hiperplasia neointimal y la reestenosis comprometen los resultados a largo plazo de la revascularización coronaria. Ha habido un rápido progreso en el campo de los transplantes de órganos a pesar del crítico problema de la escasez de donantes. Desafortunadamente también en los transplantes la reestenosis juega un papel importante ya que puede llevar a un engrosamiento intimal crónico y a una enfermedad arterial oclusiva del órgano implantado en un proceso que se denomina arteriosclerosis acelerada asociada al transplante [1].

Para tratar de disminuir las reestenosis y para abordar otros desórdenes cardiacos y vasculares, los especialistas cardiovasculares se han unido a los científicos moleculares. Las intervenciones moleculares a nivel cardiaco incluyen iniciativas para manipular los trombocitos (plaquetas), células endoteliales, células musculares lisas y miocitos cardíacos en un intento de corregir otras enfermedades fundamentales del miocardio. La terapia molecular está tomando un lugar preponderante entre las distintas opciones que en el futuro se utilizarán para el tratamiento de los padecimientos cardiovasculares. Los futuros avances tecnológicos podrán utilizar las técnicas moleculares en forma independiente o como complemento de las técnicas médicas o quirúrgicas actuales. Algunos proyectos intentan intervenir con los mecanismos transmembrana intracelular y de la superficie celular. Estos incluyen la mediación célula-célula y la interacción célula-matriz intercelular. Otras tecnologías intentan modular interacciones a nivel subcelular a través del aumento de mecanismos nucleares, ya que al manipular los genes que llevan el código genético para proteínas específicas y o la transcripción de factores, se pueden cambiar las características fenotípicas. El propósito de este trabajo es hacer una revisión de los aspectos moleculares de la enfermedad cardíaca y vascular. El campo de la medicina molecular está creciendo en forma exponencial y es imposible cubrir todos los aspectos en esta breve reseña. Sin embargo el revisar la información disponible en la "era molecular", desde su pasado histórico hasta los aspectos futuros de la terapia genética, permitirán familiarizar al perfusionista con la tecnología y la terminología de las terapias cardiovasculares basadas en la manipulación genética. Esta revisión no incluye los caminos moleculares que controlan el desarrollo y la formación del corazón, ni tampoco las mutaciones que alteran el control de la presión arterial. Para consultar la información sobre estos temas el lector es referido a la sección Otras Lecturas al final de este trabajo.

La biología molecular es una tecnología relativamente nueva y considerada por algunos recién en su infancia. Siglos de investigación en las ciencias básicas han permitido en las últimas décadas avanzar en la biología molecular. Aunque resumidos e incompletos es importante mencionar algunos eventos que han precedido el desarrollo de la biología molecular tal como la conocemos hoy en día. Los eventos históricos y la cronología que se mencionan mas abajo fueron extractados de The Dictionary of Genetics de King y Stansfield [2]. El lector es referido a este texto para referencias adicionales de información [3-8].

Como King y Stansfield conjeturan, un gran concepto a menudo se materializa luego que muchas autoridades en un tema se agrupan para obtener una explicación durante un tiempo, todos convergen hacia la respuesta, y finalmente un científico lo expresa de una manera clara [2]. Este científico a menudo es citado como el progenitor de la idea, aunque no es el único [2]. Los descubrimientos básicos han guiado nuestros conocimientos actuales acerca de la expresión genética y de la herencia genética.

La primer descripción de las células fue hecha por Hooke en 1665. Recién 150 años mas tarde, Brown reconoce el núcleo celular. Poco tiempo después Schleiden y Schwann describen la teoría del desarrollo celular y la hipótesis de que todos los animales y plantas estaban constituídas por células. Poco antes de finalizar el siglo XIX, Mendel publica su trabajo sobre la hibridización experimental en plantas, pero ese trabajo fue ignorado. Mas tarde, Meischer publica las técnicas para el aislamiento del núcleo celular, Fleming acuña el término cromatina, Roux sugiere que dentro del núcleo hay filamentos que llevan los factores hereditarios y Waldeyer acuña el término cromosoma cuando se refiere a esos filamentos [2] . Todos estos importantes hallazgos acerca del material nuclear han probado ser cruciales para la futura comprensión de la célula y de la biología molecular.

En 1896, Wilson publica The Cell in Development and Heredity, y allí expone varios conceptos de citología que comprenden la estructura, la función y la historia vital de la célula [2].

Batesman introduce el término genética a principio de 1900 y Garrod fue uno de los primeros autores al comentar sobre la bioquímica de la genética humana en su publicación Inborn Errors in Metabolism [2,5]. Los estudios de Johannsen sobre la herencia del tamaño de la semilla lo llevaron a acuñar los términos de gene, genotipo y fenotipo [2]. Hoy en día el gene es definido como una región del DNA (ácido desoxirribonucleico) que controla una característica hereditaria definida; el genotipo describe la constitución genética de una célula individual o de un organismo; y fenotipo se refiere a las características físicas que se observan en un organismo [3]. A Morgan se le otorgó el Premio Nobel en 1933 por el desarrollo de la teoría del gene. Numerosos estudios fueron agregando una abundancia de información. El mojón mas famoso fue en 1962 con los trabajos sobre el ácido desoxirribonucleico (DNA), que es el portador de la información genética. A Watson y Crick se les otorgó el Premio Nobel por sus estudios de la estructura de doble helicoide del DNA.

Posteriormente con el advenimiento del DNA recombinante (moléculas formadas al unir segmentos de DNA de diferentes fuentes), los biólogos de todo el mundo se unieron en un esfuerzo para guiar la investigación, y el Comité del DNA Recombinante del NIH (National Institute of Health, USA) estableció en conformidad las líneas directivas [2]. La comprensión de los mecanismos y la tecnología del DNA recombinante aumentó los conocimientos de la patogénesis, homeostasis, naturaleza humana y evolución [6]. El DNA recombinante es utilizado para clonar (hacer copias de) genes. Las técnicas del DNA recombinante han proporcionado a las compañías de biotecnología la capacidad de suministrar valiosas proteínas utilizadas terapéuticamente en una variedad de desórdenes causados por una deficiencia polipeptídica [7]. En 1982 Eli Lilly fue la primer compañía farmacéutica que introduce en el mercado una droga hecha con tecnología del DNA recombinante; esta droga, la insulina humana se introdujo en el mercado con el nombre comercial de humulina [2]. En 1997 una oveja llamada Dolly fue el primer mamífero clonado, llevando al primer plano de la sociedad, el entendimiento del impacto que puede brindar el uso de la tecnología del DNA.

Por mas de diez años ha habido un consenso general que con la introducción de la biología molecular se incrementaría excepcionalmente la capacidad de deducción y análisis 4. Esto ha sido probado con el tiempo y ha sido debido en gran parte a las técnicas mas recientes en la investigación de las ciencias básicas y en el campo médico. En 1988, Childs haciendo un comentario acerca de la 'revolución' en biología molecular y en genética, sugiere que el número de las ideas que son testeadas que ha crecido en forma exponencial, así como el conocimiento acumulado ha sido posible gracias al alcance y versatilidad de las técnicas del DNA recombinante [4]. Por lo tanto se le atribuye a la ingeniería genética y al DNA recombinante el haber revolucionado la biología molecular. Valle y Mitchell concluyen que estas técnicas poderosas de investigación dan la oportunidad de determinar la naturaleza intrínseca de los defectos, así como permiten entender como las mutaciones afectan la síntesis, modificación, procesamiento y localización de importantes productos genéticos [5]. Cuando Garrod inventó el término 'errores innatos del metabolismo', el estaba describiendo una deficiencia hereditaria enzimática. Actualmente el mismo término se refiere a todos los desórdenes bioquímicos cuya causa son defectos en la estructura o función molecular, y que están determinados genéticamente [8]. Por consiguiente una mutación particular puede producir enzimas defectuosas, proteínas anómalas (en su función o su estructura) o receptores alterados (receptores célula-célula, o receptores célula-matriz). Para conceptualizar claramente como defectos en una proteína o receptor pueden afecta la función cardiovascular, y pueden tener su impacto en las intervenciones médicas o quirúrgicas, remitimos al lector a los datos expuestos mas abajo.

Se han investigado intensamente a las plaquetas, las células endoteliales, las células musculares lisas y los miocitos cardíacos para determinar su grado de compromiso en la generación de la enfermedad cardíaca y cardiovascular. En particular se ha profundizado el conocimiento en los mecanismos ligando-receptor, en la interacción célula-célula, y en las interacciones entre las células y la matriz intercelular, fundamentalmente para desarrollar objetivos hacia donde orientar la terapéutica [9]. Los ejemplos incluyen los receptores apolipoproteicos y las moléculas de adhesión (integrinas). A esto se le suman los estudios que se están llevando a cabo para la señalización de las vías de modulación fenotípica de productos genéticos, como son determinadas proteínas y factores de transcripción [9,10]. Aquí los cambios ocurren a nivel nuclear, comprendiendo a segmentos del DNA que influyen en la generación de proteínas defectuosas. Se puede agregar que está en camino una investigación en terapia genética que comprende la manipulación del ciclo celular, investigación cuyo impacto final probablemente permita controlar la enfermedad vascular [11-15]. Para consideración de los lectores, se incluyen en este manuscrito citas bibliográficas de varias fuentes. Las fuentes de información son [15,31,32] un número de Science [9,10] en el que se pone en relevancia la medicina cardiovascular, un número de Journal of the Texas Heart Institute [16-22] sobre cardiología celular y molecular, el texto Molecular Cardiovascular Medicine [22-30] y literatura adicional que se cita al final de este trabajo [15,31,32].

Keating y Sanguinetti revisan el desarrollo y las implicaciones de una variada cantidad de formas de enfermedad cardíaca y cardiovascular congénita [10]. Algunas arritmias cardíacas, las cardiomiopatías y enfermedades del endotelio vascular tienen implícitos defectos en los canales iónicos, o en las proteínas contráctiles, o en las proteínas estructurales y/o en moléculas de señalización. Consideremos a continuación la patogénesis de algunos de estos desórdenes particulares.

En el síndrome del QT prolongado (LQT) se han detectado proteínas defectuosas, cuyo mecanismo de acción esta actualmente en estudio. Por lo menos hay tres proteínas aberrantes implicadas en este síndrome y mientras algunos mecanismos patogénicos son conocidos aún falta determinar todos los mecanismos fisiopatológicos [10,31]. Simplificando se puede afirmar que subunidades de los canales de potasio presentan anormalidades en el LQT, estas anormalidades son debidas a un error en un gene que lleva a un error en el producto proteico. Una subunidad errónea en un canal iónico puede causar un potencial de acción transmembrana inadecuado. Y así, en lugar de una despolarización y repolarización sincronizada, existe un potencial de acción prolongado congénitamente y a veces puede aparecer una despolarización inmadura [10,31]. A esta anormalidad fisiológica se le imputa el incremento del riesgo de arritmias severas que ponen en peligro la vida del paciente [10,31]. Potencialmente el conocer el código del DNA para subunidades normales de los canales del ión potasio corregiría esta patología.

La cardiomiopatía familiar hipertrófica (FHC) puede ser debida a defectos de las proteínas celulares cardíacas, entre ellas la betamiosina de cadena pesada, la alfa tropomiosina, la troponina T y/o la proteína C cardíaca unida a la miosina [10,17,28,29,31]. Esta cardiomiopatía es un desorden genético dominante autosómico heterogéneo en el que la pared ventricular se encuentra engrosada y donde esta disminuida la capacidad de llenado del ventrículo [10,17]. Existen cuatro genes que llevan la codificación para las proteínas contráctiles; consecuentemente el producto defectuoso genéticamente genera al menos una proteína contráctil de características patológicas que finalmente lleva a un defecto estructural arquitectónico y la consecuencia es la hipertrofia ventricular [10]. Otras proteínas aberrantes han sido implicadas en la cardiomiopatía dilatada (DCM) y que se deberían a defectos de la cadena oxidativa con reducción subsecuente del metabolismo energético y posterior injuria miocárdica con dilatación de las cavidades [10,17]. La corrección del gene aberrante o el producto de ese gene (proteína defectuosa) sería la terapia ideal para ciertos tipos de FHC y DCM.

La célula endotelial es el centro de las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. En consecuencia es el sitio que mas intensamente ha sido estudiado [18, 32-35]. El tratamiento de la superficie celular, por intermedio de moléculas con interacción célula-célula y célula-matriz pueden brindar en el futuro un medio para mejorar los resultados de las actuales técnicas de revascularización médicas o quirúrgicas [9]. las técnicas de revascularización no alteran el genotipo de los paciente. En su lugar, incrementan el flujo sanguíneo por intermedio de una intervención sea esta una angioplastía percutánea o un stent o un bypass quirúrgico. Los pacientes con enfermedad vascular tienen una disfunción endotelial de causa genética o producida por factores ambientales. La terapia molecular permite una intervención en los primeros estadios del esquema gene defectuoso-producto genético aberrante. Por consiguiente el impedir farmacológicamente la expresión genética tendrá como resultado evitar el fenotipo defectuoso. Los vasos sanguíneos manipulados por la introducción de genes que lleven la codificación para los mediadores de vasodilatación, o factores anti inflamatorios o factores angiogénicos deberían aumentar la permeabilidad vascular [36-39]. Por ejemplo, en un esfuerzo para reemplazar un producto fundamental de las células endoteliales, se ha utilizado la sintetasa del oxido nítrico (NO), por su capacidad de producir una profunda inhibición de la contracción del músculo liso, así como de su migración y proliferación. El gene portador de la sintetasa del óxido nítrico ha sido recientemente introducido (vector con DNA incorporado) a las células vasculares luego de producir un daño con balón en el modelo experimental de las ratas [39].

De la misma manera, el metabolismo defectuoso del colesterol también ha sido blanco de los estudios ya que predispone a los pacientes a la enfermedad vascular [19,25]. Por ejemplo la hipercolesterolemia familiar (FH) tiene como patología un receptor anómalo de una lipoproteína de baja densidad aberrante y puede causar ateroesclerosis. Se ha demostrado que esta forma de ateroesclerosis está causada por la ausencia de receptores de LDL en homocigotas y por su inadecuada expresión en heterocigotas [40]. Otros tipos de desordenes de las lipoproteínas se han clasificado también como enfermedades hereditarias del endotelio vascular. Keating y Sanguinetti han incluido las apolipoproteínas defectuosas B y E en esta categoría debido a su reducida capacidad de unión de estas y a una alteración del metabolismo del colesterol, lo que esta asociado a un incremento del riesgo de padecer ateroesclerosis [10]. El incremento de la actividad aglutinante debería aumentar el metabolismo lipídico.

Al igual que con las arritmias y con los desórdenes miocardiopáticos, el enfoque actual en la terapia molecular para la enfermedad vascular, comprende el entender y corregir errores específicos en los genes y en los productos de estos que se manifiestan en una patología particular.

En adición a los defectos asociados con la ateroesclerosis (p.e. dislipoproteinemias y trastornos del metabolismo del oxido nítrico), también pueden contribuir a la disfunción vascular enfermedades que afectan la integridad de la matriz intercelular. Por ejemplo la elastina defectuosa es un factor que lleva a problemas en el desarrollo vascular, susceptible de daño recurrente, como se puede ver en la estenosis aórtica supravalvular [10 ,30]. Asimismo el síndrome de Marfan es debido a un gene defectuoso, denominado fibrilina-1, que predispone al paciente a una dilatación y/o disección vascular, y que está asociado con defectos del tejido conectivo [9, 10, 31, 41]. Nuevamente en estas situaciones la corrección de los genes y/o los productos genéticos, para los defectos de la fibrilina-1 y de la elastina, debería ser la terapia ideal.

Resumiendo se puede decir que los defectos de una variedad de productos genéticos están implicados en la enfermedad cardíaca y vascular. A menudo los estados patológicos son multifactoriales en su origen, comprendiendo mas de un gene (poligénicos) y también causas ambientales. En forma alternativa algunos defectos son manifestaciones de un único error genético o de la producción de un gene (monogénico). Últimamente nuevas técnicas de análisis han mejorado nuestra percepción de la variedad y cantidad de trastornos genéticos en el hombre. Una de esas técnicas es la del análisis de cohibición enzimática [4]. Las endonucleasas de cohibición son enzimas que seccionan (digieren) el DNA de una manera particular proporcionando datos analíticos que permiten grandemente mejorar nuestra aptitud para recoger y entender la información. Esta procedimiento es utilizado en diversas técnicas genéticas, como por ejemplo en la determinación de la longitud del polimorfismo de los fragmentos de cohibición (RFLP). Este RFLP se define como las diferencias hereditarias en sitios en los cuales las enzimas de cohibición seccionan el DNA, cuando el largo de esos segmentos de DNA difieren entre sí. Por ejemplo pacientes con una enfermedad en particular en general producen fragmentos de cohibición anormales [4]. Es interesante comentar que el polimorfismo del DNA es un marcador genético que ha sido utilizado en la medicina forense (p.e. huellas digitales y evidencia por el DNA).

Finalmente, luego de todos estos comentarios sobre defectos de los genes y/o productos genéticos, cual es el papel de la terapia genética?. Se puede aplicar a la enfermedad cardíaca y vascular?. Cual es la relevancia en la perfusión cardiovascular?.

La terapia genética consiste en la introducción de un gene extraño en una determinada célula. Esta técnica es utilizada para corregir enfermedades que son el resultados de genes defectuosos y ha sido utilizada en ensayos clínicos para tratar la deficiencia de deaminasa de adenosina (ADA) [42-45], la fibrosis quística (CF) [42,44] como así también la hipercolesterolemia familiar (FH) [14,42-44].

Un método comúnmente utilizado para introducir el gene de interés en la célula determinada es conectar el gene a DNA viral. Luego se inyecta este virus que puede ser un adenovirus con deficiencia de la replicación o un retrovirus que acarrea el gene extraño al organismo receptor. Como con cualquier infección viral el virus ingresa a la célula. Si lo que es utilizado es un retrovirus, el DNA viral se integra al genoma huésped en forma aleatoria y comienza a expresarse como parte del genoma del huésped. Una desventaja de utilizar vectores retrovirales es la chance que por medio de una mutación el vector retroviral se transforme en patógeno por medio de una mutación espontánea. También existen restricciones en cuanto al tamaño del gene que puede ser insertado en los vectores retrovirales. Con el uso de vectores de adenovirus, el DNA permanece fuera de los cromosomas y se lo denomina epicromosómico [13,27]. En consecuencia la presencia y la expresión del gene es transitoria y la terapia genética requiere que el gene recombinante sea inyectado o vuelto a administrar en el tejido animal luego de un período de tiempo. Los vectores adenovirales pueden ser preparados en concentraciones altas, purificados y concentrados bastante fácilmente y pueden alojar genes de gran tamaño. Estas ventajas hacen que los vectores adenovirales sean mas atractivos que los vectores retrovirales. La mayor desventaja con los adenovirus es que algunos productos genéticos virales son tóxicos para el huésped y pueden provocar una reacción inmune contra las células del huésped 43, 46. Además de estos dos vectores existen otros vehículos y/o métodos para la transferencia genética. Ellos son vectores virales asociados a adenovirus, vectores catiónicos mediados por liposomas, microinyección directa y transporación eléctrica. Las ventajas y desventajas de estos últimos métodos se detallan en la bibliografía [12-15,27,43,44,48].

Desde que los diversos agentes farmacológicos no atacan la causa básica de muchos desórdenes cardíacos y vasculares, un método alternativo podría ser la terapia genética. Incluso condiciones patológicas como la re-estenosis coronaria, con factores etiológicos contribuyente sean estos genéticos o ambientales, tienen potencialmente la posibilidad de ser corregidos con terapia genética [49]. Los ejemplos que se dan a continuación definen las bases de la terapia genética para enfermedades del miocardio y del endotelio vascular. Se incluye la terminología básica apropiada ya que la pronta asimilación de esos términos nos ayudará a unir el DNA a la cirugía [50].

En la enfermedad cardíaca del alargamiento del QT (LQT), un gene normal que lleva la codificación para un canal normal transmembrana del ión potasio puede ser introducido en las células patológicas. Para esta técnica se requiere que el gen defectuoso responsable de la anormalidad del canal iónico sea individualizado. El gene de un individuo normal puede subsecuentemente ser expresado para conocer los elementos codificados apropiados, señalar el mRNA y el cDNA. El mRNA es el RNA mensajero, formado como réplica del DNA, y su función es la traducción ordenada de los aminoácidos específicos, conteniendo sus instrucciones básicamente en una sola cadena molecular. El cDNA o DNA copia es el término que se utiliza para referirse al DNA complementario que se forma como réplica a partir de la plantilla del mRNA. El cDNA es insertado en un vector apropiado para obtener el DNA recombinante. Los distintos pasos, que incluyen la detección e identificación del gene en cuestión, la producción y aislamiento del cDNA, la formación y amplificación vía una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gene recombinante, pueden ser complejos y costosos. Sin embargo una vez que el cDNA para el canal iónico normal es conectado a su vector viral, el gene recombinante puede ser clonado y purificado en forma relativamente fácil con vectores adenovirales y ser utilizado en forma continuada en diferentes pacientes. En este ejemplo es de importancia reconocer que el gene mutado sigue pudiendo expresarse, produciendo el canal iónico no funcionante o malfuncionante, pero el aporte de canales normales suplementados por el DNA viral pueden reducir el defecto intrínseco. El resultado es la sobrevida de estos pacientes que padecen este tipo específico de arritmia cardíaca. De manera similar los defectos de proteínas estructurales y funcionales pueden ser objetivos potenciales y por consiguiente al se pueden corregir las causas subyacentes de cardiomiopatías (proteínas contráctiles en la FHC y defectos mitocondriales en la DCM) [10,17] y de desórdenes vasculares (elastina y fibrilina defectuosas)[10,31,41].

La ateroesclerosis es una enfermedad cardiovascular en la que mecanismos celulares y extracelulares producen un estrechamiento en la luz de los vasos sanguíneos [24,25]. Desde la investigación de Goldstein y Brown en hipercolesterolemia, trabajo que marcó un punto de partida, se ha realizado un rápido progreso en el entendimiento de la patología de esta enfermedad, principal causa de muerte en el mundo occidental. A esto se le suma la investigación sobre un modelo de rata deficiente en apo E (hiperlipoproteinemia tipo III), que tiene la particularidad de tener una ateroesclerosis similar a la de los humanos [51]. La introducción del gene de apo E en las células hepáticas sin embargo puede no revertir el problema ya que la ateroesclerosis puede ser debida a otros factores, incluyendo a LDL defectuoso, a trastornos en los receptores de LDL (FH), apolipoproteínas B aberrantes (hipobetalipoproteína), homocistinuria, hormonas, efectos ambientales y drogas [10,25,52]. Cuando varios factores están imputados como la causa de un desorden, el primer paso es diagnosticar la causa del problema. En la ateroesclerosis debida a mutación de los receptores del LDL, o en las deficiencia de apo E, la administración del gene correcto puede potencialmente revertir el problema.

La terapia con drogas puede reducir los síntomas de la enfermedad genética y/o dar una mejoría temporaria. Sin embargo la terapia genética brinda una mejor opción ya que la técnica puede ser utilizada para atacar la causa básica de un defecto genético subyacente alterando la estructura genética de los individuos en un esfuerzo hacia la corrección permanente de la patología. Hay que reconocer que la terapia genética esta aun en sus primeros estadios. Los costos, los desafíos técnicos como puede ser la respuesta inmune del huésped y las cuestiones éticas necesitan ser puestas en su contexto en esta nueva técnica que promete un futuro mejor para los individuos con desórdenes genéticos.

Las técnicas del bypass cardiopulmonar pueden ser empleadas para implementar tipos específicos de transferencia genética ?. Hasta el año 1998 debido a varias razones no había ninguna evidencia en la literatura. Las consideraciones sobre esta cuestión deben hacerse sobre la seguridad, la eficacia y obviamente la necesidad. El modo óptimo de exponer los vasos a los vectores virales y no virales aún no está del todo claro. Algunas aplicaciones han incluido técnicas en vasos periféricos en los cuales se instilaba durante 30 minutos el elemento terapéutico y luego se restauraba el flujo sanguíneo anterógrado normal [53]. En la actualidad se están definiendo distintas configuraciones y diseños de los catéteres para la entrega del material genético [54]. Uno de estos estudios se refiere a un catéter con canales de perfusión sanguínea distal, durante el período de oclusión utilizado para la transferencia genética en la enfermedad vascular arterial [54]. Una de las mayores desventajas con estos prototipos de catéteres ha sido el lavado del vector del DNA en la corriente sanguínea y que será seguramente evitado con nuevos diseños de catéteres [13]. Para incrementar las tasas de transferencia genética, y por consiguiente asegurar una mayor expresión del producto genético en cuestión, la forma de aplicación podría incluir una parada extendida del flujo sanguíneo, requiriendo así técnicas de perfusión cardiovascular. La consecuencia directa sería la disminución del lavado del vector y el incremento del tiempo de exposición del vector/DNA en las células. Poco es lo que sabe aun en cuanto a la transferencia genética asistida por el bypass cardiopulmonar. La mayor parte de los trabajos comprenden al sistema vascular arterial periférico, aunque tanto las arterias cerebrales y del resto del aparato cardiovascular son de particular interés debido al impacto que tienen en la mortalidad.

Los perfusionistas son los encargados de conducir técnicas de bypass cardiopulmonar que brindan a los cirujanos un campo sin sangre y sin movimiento. Una vez que se demuestre la seguridad y la eficacia de la transferencia genética a las arterias coronarias, las técnicas de perfusión que se utilizan en la actualidad podrán ser rápidamente modificadas para asistir a esta nueva forma terapéutica. Por ejemplo las técnicas del bypass cardiopulmonar para soporte ventricular, parada cardíaca y preservación de órganos pueden mantener una perfusión periférica adecuada y permitir un período extenso de tiempo para la instilación de los vectores. Asimismo las técnicas de perfusión para órganos aislados y/o de perfusión de miembros también tienen potencialmente su indicación.

En cuanto a la cirugía del bypass y la reestenosis están apareciendo trabajos nuevos y con un amplio futuro. Estos se refieren a la manipulación del ciclo celular [11-13,27, 55-58]. El ciclo celular consiste en fases de síntesis de DNA y de división celular y los mediadores que regulan estos procesos. Unas kinasas proteicas ciclo dependientes (Cdk) y unas proteínas activadoras llamadas ciclinas, son los mediadores del control del ciclo celular [3]. El conocimiento adquirido de los estudios acerca del ciclo celular está siendo aplicado a intervenciones sobre los vasos sanguíneos. Man y colegas han subrayado la habilidad de intervenciones agudas en la expresión genética por métodos de preservación de la función endotelial en ratas modificadas por medio de ingeniería genética a través de la inhibición del ciclo celular [55]. Nabel lideró otro grupo de investigadores que puso énfasis en la utilidad de la terapia genética viral con la enzima kinasa de la timidina (tk) combinada con una droga antiviral, el ganciclovir, para bloquear células de músculo liso en el cerdo [59]. Alternativamente, el aumento de la actividad del oxido nítrico, por vía de la transferencia genética, es un enfoque prometedor para la prevención de las estenosis de las venas utilizadas en los bypass [12,39]. Otros pronostican que un cocktail de genes como la mejor chance de éxito clínico en la prevención de diferentes aspectos de la reestenosis [11]. La revascularización quirúrgica junto con la Angioplastía / Stent podrían trabajar en combinación con la terapia genética para reducir la tasa de reestenosis [9,11,14,56,60]. Por ejemplo los conductos para bypass podrían ser tratados en el momento de la cirugía inicial, previamente a la sutura de estos conductos a los vasos receptores [11,56].

La angiogénesis se define como neovascularización postnatal. La investigación en angiogénesis es a la vez fascinante como importante debido a sus potenciales aplicaciones clínicas. Es interesante mencionar que los estudios en la formación de los vasos sanguíneos se iniciaron en las investigaciones sobre tumores ya que estos son dependientes de la angiogénesis. A Folkman se le acredita la hipótesis original [61]. Actualmente Folkman establece tres líneas generales de investigación, originariamente derivadas de sus observaciones iniciales. Estas tres líneas de investigación son: (1) marcadores pronósticos en pacientes portadores de cáncer, (2) terapia anti angiogénica y (3) terapia angiogénica [62]. En cuanto a la terapia angiogénica, Isner ha sido el pionero en el campo de la terapia genética para la enfermedad arterial. Isner y colaboradores utilizan actualmente una estrategia que incluye una transferencia sitio específica de una plasmido de DNA, que lleva codificado 165 aminoácidos isofórmicos del factor de crecimiento vascular endotelial humano (phVEGF165) [63,64]. Estos autores han demostrado evidencias clínicas de angiogénesis en pacientes con isquemia crítica de los miembros. Un enfoque adicional incluye la aplicación del factor de crecimiento fibroblástico humano-1 (FGF-1) [65]. En forma alternativa otros autores han utilizado una transferencia genética directa in vivo al miocardio utilizando un vector adenoviral deficiente en la replicación [66]. Los tratamientos de neovascularización son utilizados para bypasear arterias coronarias. El DNA de las hormonas de crecimiento ha sido administrado durante la cirugía con circulación extracorpórea [65]. Esto ha sido sugerido como una estrategia terapéutica para los pacientes en quienes una revascularización completa no es posible de conseguirse con las actuales técnicas médicas o quirúrgicas. Recientemente se ha demostrado que se puede inducir el desarrollo de circulación colateral utilizando un vector adenoviral que exprese VEGF(2)cDNA [67]. Todos estas modalidades terapéuticas permiten aumentar las esperanzas de los pacientes con enfermedad vascular. (Un interesante hallazgo colateral a estas investigaciones es que el VEGF puede brindar una protección miocárdica adicional contra la injuria isquemia - reperfusión en corazones de ratas, cuando se lo agrega a una solución de cardiplejia hiperkalémica) [68].

Se están llevando a cabo ensayos clínicos con protocolos de terapia genética bajo el control de la Food and Drug Administration (FDA) y el National Institute of Health (NIH) Recombinant DNA Advisory Comité. Varios resúmenes en Medline de 1998 y varios sitios en Internet brindan puntos de vista optimistas. Una desventaja de la terapia genética en enfermedades como la CF ha sido la necesidad de readministrar los genes debido a las respuestas inmunes de los pacientes; sin embargo en cuanto a la angiogénesis un efecto transitorio inicial puede ser suficiente para mejorar el cuadro clínico. Un factor limitante potencial en las estrategias de formación neovascular en tejidos isquémicos pareciera residir en la competencia de respuesta que tienen las células endoteliales (EC8) a las citoquinas angiogénicas [64,69-71]. Las células endoteliales progenitoras, lugar donde se ejerce la acción angiogénica, han sido consideradas el lugar donde actúan los vectores de la terapia genética [70,71]. Ashara y colaboradores han podido aislar estas células progenitoras del endotelio sujetas a la angiogénesis. Células aisladas han sido analizadas para demostrar la progresión de marcadores in vitro específicos para este tipo celular y obtener así varias evidencias de laboratorio de un fenotipo celular símil célula endotelial [70,71]. Asimismo estos investigadores han presentados resultados en modelos de isquemia del tren posterior en ratas y conejos que demuestran que progenitores de células endoteliales heterólogas, homólogas y autólogas se incorporan a los sitios de angiogénesis activa [70,71]. Ante la evidencia que estas células progenitoras son las productoras de angiogénesis , sugieren que estas células tienen el potencial de ser utilizadas como vectores autólogos para la terapia genética [70,71]. Por las mismas razones se especula que la utilización de esas células puede ser usadas como tratamiento para aumentar la angiogénesis o como terapia anti neoplásica [70,71].

A medida que los perfusionistas se preparan para los desafíos técnicos de futuros enfoques de la cirugía cardíaca, tecnología de nuevos dispositivos y novedosas avances farmacológicos, iremos asistiendo cada vez mas a nuevas terapias genéticas para el tratamiento de las enfermedades cardíacas y cardiovasculares. Aunque la investigación en los genes y las técnicas de ingeniería del DNA fueron investigadas originalmente para aumentar el conocimiento y la visión en profundidad de la biología molecular, comprensiblemente el ángulo de enfoque fue dirigido hacia las intervenciones cardíacas y cardiovasculares [13]. Todas las terapias que requieren la instilación de vectores y/o DNA para codificar nuevos productos genéticos en órganos aislados o parados requieren de las técnicas de perfusión cardiovascular. Previamente a que estos nuevos tratamientos estén completamente definidos es necesario solucionar algunos desafíos técnicos. Las vallas con que nos enfrentamos en la actualidad en el campo de la terapia genética incluyen aspectos específicos de la farmacokinesia de los vectores, los métodos de aplicación así como la eficacia de la expresión genética [72]. Desde que la seguridad para el paciente sigue siendo lo primordial, la preocupación mas importante es la respuesta inmune a la terapia genética. Aunque todavía no se han resuelto algunos aspectos éticos en cuanto a la terapia genética y a la manipulación del genoma humano, las metodologías están en rápido progreso.

Finalmente, a medida que experimentemos con nuevas aplicaciones de la biología molecular enfocada a problemas de interés en el campo de las enfermedades cardíacas y cardiovasculares, recordemos una elocuente analogía de Weschler, y en consecuencia preparémonos para esta nueva oportunidad que se nos ofrece, aumentando nuestras chances de éxito, en esta cruzada que recién comienza en un campo poco explorado, con el conocimiento del lenguaje y sus costumbres [73].

BIBLIOGRAFIA

1. Libby P, Schoen FJ, Pober JS. Arteriosclerosis of cardiac transplantation. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. Mew York: Scientific American, 1995: 311-24.

2. King RC, Stansfield WD. A dictionary of genetics, 5th edition. Oxford: Oxford University Press, 1997.

3. Alberts B, Bray D, Lewis I, Raff M, Roberts K, Watson ID. Molecular biology of the cell. New York: Garland Publishing, 1994.

4. Childs B. Introduction. In: Childs B, Holtzman NA, Kazazian HH, Valle DL eds. Molecular genetics in medicine: progress in medical genetics, Vol. 7. New York: Elsevier Scientific, 1988: 1-16.

5. Valle DL, Mitchell GA. Inborn errors of metabolism in the molecular age. In: Childs B. Holtzman NA, Kazazian HH, Valle DL eds. Molecular genetics in medicine: progress in medical genetics, Vol. 7. New York: Elsevier Scientific, 1998: 100-42.

6. Childs B, Motuisky AG. Recombinant DNA analysis of multifactorial disease. In: Childs B, Holtzman NA, Kazazian HH, Valle DL eds. Molecular genetics in medicine: progress in medical genetics, Vol. 7. New York: Elsevier Scientific, 1988: 180-94.

7. Arnhelim N, Erlich HÁ. Commercial uses of recombinant DNA technology in human genetic disease. In: Childs B, Holtzman NA, Kazazian HH, Valle DL eds. Molecular genetics in medicine progress in medical genetics. Vol.7 New York: Elsevier Scientific, 1988: 195-219.

8. Rosenberg LE: Inborn errors of metabolism. In: Metabolic control and disease. Philadelphia, PA: WB Saunders, 1980: 73-102.

9. Gibbons GH, Dzau VI. Molecular therapies for vascular diseases. Science 1996; 272: 689-93.

10. Keating MT, Sanguibetti, MC. Molecular genetic insights into cardiovascular disease. Science 1996; 272: 681-85.

11. Barinaga M. Gene therapy for clogged arteries passes test in pigs. Science 1994; 265: 738.

12. Von Der Leyen HE, Mann MI, Dzau VI. Gene therapy of cardiovascular disorders. In: Alexander RW, Schlant RC, Fuster V, O´Rourke RA, Robert R, Sonnenblick, EH eds. Hurs´s The Heart, 9 th edition. New York: McGraw - Hill, 1998: 213-25.

13. Nabel EG, Pompili VI, Plautz GE, Nabel GJ. Gene transfer and vascular disease. Cardiovascular Research 1994; 28: 445-55.

14. Rowland RT, Cleveland JC, Xianzhong M, Harken AH, Broen JM. Potential gene therapy strategies in the tratment of cardiovascular disease. Ann Thorac Surg 1995; 60: 721-28.

15. Li K, Buvoli M, Welikson RE, Vikstrom KL, Leinwand LA. Advances in cardiovascular gene transfer. Cardiologia 1997; 42: 39-46.

16. Shih HT. Anatomy of the action potencial in the heart. Texas Heart Institute J 1994;21: 30-41.

17. Marian AJ, Roberts R. Molecular basis of hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Texas Heart Institute J 1994; 21: 6-15.

18. Vanhoutte PM, Scott-Burden T. The endothelium in health and disease. Texas Heart Institute J 1994; 21: 62-67.

19. Ballantyne CM, Chan L, Morrisett ID, Mims MP, Gotto AM. Recent advances in lipoprotein and atherosclerosis resarch at Baylor College of Medicine. Texas Heart Institute J 1994; 21: 48-55.

20. Casscells W, Engler D, Willerson IT. Mechanisms of restenosis. Texas Heart Institute J 1994; 21: 68-77.

21. Majesky MW. Neointima formation after acute vascular injury: role of counter adhesive extracellular matrix proteins. Texas Heart Institute J 1994; 21: 78-85.

22. Scott-Burden T, Vanhoutte PM. Regulation of smooth muscle cell growth by endothelium-derived factors. Texas Feart Institute J 1994; 21: 91-97.

23. Haber E. The impact of molecular biology on cardiovascular medicine. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 1-10.

24. Kneger M. Lipoprotein receptors and atherosclerosis. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 11-30.

25. Kneger M. Lipoprotein receptors and atherosclerosis. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 31-47.

26. Klagsbrun M. Vascular cell growth factors and the arterial wall. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 63-78.

27. Nabel EG, Nabel GJ. Gene therapy for cardiovascular disease. In: Haber E ed: Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 79-96.

28. Zak R. Molecular mechanisms of cardiac hypertrophy. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American. 1995: 177-92.

29. Seidman CE, Seidman JG. Gene mutations that cause familial hypertrophic cardiomyopathy. In: Haber E ed. Scientific American molecular vardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 193-209.

30. Fozzard HA. Ion channels and cardiac function. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 211-24.

31. Chien KR, Shimizu M, Hoshijima M, Minamisawa S, Grace AA. Toward molecular strategies for heart disease: past, present, future. Jpn. Circ J 1997; 61: 91-118.

32. Gibbons GH, Dzau VJ. The emerging concept of vascular remodeling. New Engl J Med 1994; 330: 1431-38.

33. Gimbrone MA. Vascular endothelium in health and disease. In: Haber E ed. Scientific American molecular cardiovascular medicine. New York: Scientific American, 1995: 49-62.

34. Gibbons GH. Endothelial function and structure: a new therapeutic target. Am J Cardiol 1997; 79: 3-8.

35. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362: 801-9.

36. Geary RL, Clowes AW, Lau S et al. Gene transfer in baboons using prosthetic vasular grafts seeded with retrovirally transduced smooth muscle cells: a model for local and systemic gene therapy. Hum Gene Ther 1994: 10; 1211-16.

37. Asahara T, Bauters C, Pastore C et al. Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured carotid artery. Circ 1995; 91: 2793-801.

38. Isner IM, Walsh K, Symes I et al. Arterial gene therapy for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease. Circ 1995; 91: 2687-92.

39. Von der Leyen HE, Gibbons GH, Morishita R et al. Gene therapy inhibiting neointimal vascular lesion: in vivo gene trabsfer of endothelial-cell nitric oxide synthase gene. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 1137-41.

40. Motuisky AG. The 1985 Nobel Prize in physiology or medicine. Science 1986; 231: 126.

41. Milewicz DM. Identification of defects in the fibrillin gene and protein in individuals with the Marfan Syndrome and related disorders. Texas Heart Institute J 1994; 21: 22-29.

42. Miller Ad. Human gene therapy. Science 1992;256: 808-13.

43. Anderson WF. Gene therapy. Sci Am 1995: 124-27.

44. Crystal RG. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success. Science 1995 ; 270: 404-10.

45. Anderson WF. Human gene therapy. Science 1992; 256: 808-13.

46. Schneider MD, French BA. The advent of adenovirus. Gene therapy for cardiovascular disease. Circulation 1993;88: 1937-42.

47. Wu KK, Zoldheslyi P, Willweson IT, Xu XM, Loose-Michell, DS, Wang LH. Gene therapy for vascular diseases. Texas Heart Institute J 1994; 21: 98-103.

48. Mulligan RC. The basic science of gene therapy. Science 1993;260: 926-32.

49. Mazur W, Ali NM, Raizner AE, French BA. Coronary restenosis and gene therapy. Texas Heart Institute J 1994; 21: 104-11.

50. Brown IM, Harken AH, Sharefkin JB. Recombinant DNA and surgery. Ann Surg 1990; 212: 178-86.

51. Breslow IL. Mouse models of atherosclerosis. Science 1996; 272: 685-88.

52. Stone NJ. Secondary causes of hyperlipidemia. Med Clinics of North Am 1994; 78: 117-41.

53. Nabel EG, Plautz G, Boyce FM et al. Recombinant gene expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall. Science 1989; 244: 1342-44.

54. Isner JM, Feldman LJ. Gene therapy for arterial disease. Lancet 1994; 344: 1653-54.

55. Mann MJ, Gibbons GH, Tsao PS et al. Cell cycle genetically engineered rabbit vein grafts. J Clin Invest 1997; 99: 1295-301.

56. Mann MJ, Gibbons GH, Kernoff RS et al. Genetic engineering of vein grafts resistant to artherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 4502-16.

57. Simons M, Edelmn ER, DeKeyser JL et al. Antisense c-myb oligonucleotides inhibit intimal arterial smooth muscle cell accumulation in vivo. Nature. 1992; 359: 67-70.

58. Ohno T, Gordon D, San H et al. Gene therapy for vascular smooth muscle cell proliferation after arterial injury. Science 1994; 265: 781-84.

59. Nabel EG, Plautz G, Nabel Gj. Site-specific gene expression in vivo by direct gene transfer into the arterial wall. Science 1990; 249: 1285-88.

60. Dichek DA, Neville RF, Zwiebel JA et al. Seeding of intravascular stents with genetically engineered endothelial cells. Circ 1989; 80: 1347-53.

61. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: 1182-86.

62. Folkman J. Angiogenic therapy of the human heart . Circ 1998; 97: 628-29.

63. Baumgartner I, Pieczel A, Manor O et al. Constitutive expression of phVEGF(165) after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circ 1998; 97: 1114-23.

64. Isner JM, Pieczek A, Schaninfeld R et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of ph VEGF(165) in patients with ischaemic limb. Lancet 1996; 348: 370-74.

65. Schumacher B, Pecher P, von Specht BU, Stegmann TH. Induction of neoangiogenesis in ischemic myoardium by human growth factors : first clinical trials of a new treatment of coronary heart disease. Circ 1998; 97: 645-50.

66. Magovern CJ, Mack CA, Zhang J et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thor Surg 1996; 62: 425-34.

67. Mack CA, Patel SR, Achwartz EA et al. Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for vascular endothelial growth factor 121 improves myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart. J Thorac Cardiovasc Surg 1998; 115: 168-77.

68. Luo Z, Diaco M, Murohara T et al. Vascular endothelial growth factor attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury. Ann Thor Surg 1997; 64: 993-98.

69. Tschudi MR, Barton M, Beresinger NA et al. Effect of age on kinetics of nitric oxide release in rat aorta and pulmonary artery. J Clin Invest 1996; 98: 899-905.

70. Asahara T, Murohara T, Sullivan A et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis . Science 1997;275: 964-67.

71. Rivard A, Isner JM. Angiogenesis and vasculogenesis in treatment of cardiovascular disease. Mol med 1998;4: 429-40.

72. Nabel EG. Gene therapy for vascular diseases. Atherosclerosis 1995; 118: 851-56.

73. Wechsler AS. Molecular biology 101. Ann Thorac Surg 1995; 60: 497-98.

Referencias Seleccionadas

Barr E, Lin H, Boiling SF et al. Induction lf angiogenesis following in vivo gene transfer into myocardium. Circulation 1991; 84: 420.

Barr E, Tripathy SK, Kozarsky K et al. PCGT, catheter based gene trabsfer into the heart using replication-deficient recombinant adenoviruses. J Cell Biochen 1993; 17: 195.

Chapman GD, Lim CS, Gammon RS et al. Gene transfer into coronary arteries of intact animals with a percutaneous ballon catheter, Circ Res 1992;71: 27-33.

Chien KR. Molecular advances in cardiovascular biology. Science 1993; 260: 916-17.

Chien KR. Molecular basis of cardiovascular disease: a companion to Braunwald"s heart disease.Philadelphia, PA: WB Saunders, 1999.

Kaplitt MG, Xial X, Samuiski RJ et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus. Ann Thorac Surg 1996; 62: 1669-76.

Leinwand LA, Leiden JM. Gene tranfer into cardiac myocytes in vivo. Trends Cardiovasc Med 1991; 1: 271-76.

Lifton RP. Molecular genetics of human blood pressure variation. Science 1996; 272: 676-80.

Olson EN, Srivastava D. Molecular pathways controlling heart development. Science 1996; 272: 671-76.

AVANCES MOLECULARES EN LA ENFERMEDAD CARDIACA Y VASCULAR.